Técnicas analíticas de isótopos en Nitratos

 

Cómo y dónde se recogen las muestras para  la determinación de los valores del d 15N  es al menos tan importante como cómo y dónde se analizan las muestras. Es por ello que se hace esencial tener en cuenta la variabilidad temporal y espacial de los distintos componentes del ciclo del nitrógeno. Se debe evitar el muestreo durante la aplicación de fertilizantes y abonos debido al rápido fraccionamiento que tienen lugar en el suelo después de la aplicación de los mismos (rápida volatilización y nitrificación del amoniaco). También es mejor tomar las muestras por debajo de los lugares de aplicación de fertilizantes y abonos, después de que los materiales que aportan N hayan sido nitrificados durante su transporte a través del suelo.

Además es conveniente realizar el muestreo de los suelos en diferentes momentos del año. En caso de que los suelos fueran de cultivo entonces el muestreo se debe realizar en diferentes momentos del ciclo del cultivo. Conviene también realizarlo a diferentes profundidades, las cuales dependerán del tipo de suelo (por ejemplo, entre 0-5cm y 5-20 cm).

Las muestras se extraen con un muestreador.

También es conveniente constituir unidades experimentales.

Se determina el contenido de:

  • N total
    El N total se puede determinar por el método de Kjeldahl modificado, en un digestor y destilador Büchi (Büchi Labortechnik AG, Switzerland). 

  • NO3--N
    Para convertir el NO3--N a NH4+-N se puede usar la aleación desarrollada por Devarda (5 g de aleación por 20 mg de NO3--N). El amonio se puede recoger por destilación (Bremner y Keeney, 1965).

  • NH4+-N

  • La relación 15N/14N

Se determina por espectrometría de emisión óptica una vez que se hayan determinado el N total, N-NO3- y N-NH4+ 

    ** El N orgánico se puede calcular como la diferencia entre el N total y el N mineral.

Para el análisis isotópico del 15N es necesario convertir el nitrato (presente en agua y suelo) en N2. Esto permite el análisis del 15N en un espectrómetro de masas. Esto implica la conversión del nitrato a amonio, seguido de la oxidación del amonio a N2 con hipobromuro de litio (Kreitler, 1975).

La cantidad de nitrógeno fijado biológicamente se determina mediante la técnica de bloque de acetileno (acetylene block technique) y dos métodos isotópicos: el método de dilución del 15N y el método de abundancia natural de 15N.

Existen varios métodos para recoger especies de nitrógeno orgánico (DON) e inorgánico (DIN) de aguas naturales y prepararlas para el análisis de d 15N. Las muestras se deben filtrar inmediatamente después de ser recogidas, usando filtros de 0,45m o más finos. Para el DON es conveniente utilizar filtros de plata. Las muestras deben mantenerse refrigeradas hasta su análisis. Normalmente, las muestras de agua se conservan con ácido sulfúrico, cloruro de mercurio (material peligroso), cloroformo, o congeladas. Es recomendable contar con el laboratorio que analizará las muestras para que ellos recomienden como deben ser conservadas.

Un método para recoger el nitrógeno inorgánico (DIN) de aguas frescas para análisis isotópicos es usar resinas de intercambio iónico (Hoering, 1957; Moore, 1977; Garten, 1992). El amonio y el nitrato se recolectan en el campo sobre resinas del catión y del anión, respectivamente y se envían al laboratorio para su análisis y procesado. Los beneficios de usar resinas de intercambio son:

- La eliminación de la necesidad de transportar grandes volúmenes de agua al laboratorio para su análisis.
- La eliminación de la necesidad de realizar preparaciones peligrosas.
- La capacidad de concentrar nitrógeno a partir de aguas muy diluidas.

Otros aniones y cationes pueden competir con éxito por los lugares de intercambio en las resinas, por lo que estas técnicas no son recomendables para aguas salinas o salobres. Por tanto, es importante tener un cierto conocimiento sobre la química del agua antes de aplicar estas técnicas.

Para el análisis en espectrometría de masas el nitrato convencionalmente se prepara destilando cualquier amonio existente, reduciendo el nitrato a amonio mediante una reacción de Kjeldahl (Bremner, 1965; Bremner y Edwards, 1965) y después convirtiendo el amonio a N2 gas. 

El nitrato se recoge mediante alguno de los métodos de intercambio iónico existentes. Posteriormente el nitrato se diluye con HCl, neutralizado con Ag2O, filtrado para remover el AgCl precipitado, liofilizado y el remanente de AgNO3 consumido a N2. Este método sólo es conveniente para aguas frescas ya que las altas concentraciones de aniones en la solución pueden interferir con la absorción de nitrato, causando un agotamiento de 15N en la muestra. Las muestras se pueden archivar, refrigerar sobre la columna, durante más de 2 años con un mínimo fraccionamiento.

Usando este método se obtienen precisiones analíticas por encima del ± 0,1‰ para el d 15N.

 

El nitrógeno orgánico disuelto (DON) normalmente se define como el N de la materia orgánica disuelta (DOM) o carbono orgánico disuelto (DOC). Normalmente el DON se recoge sobre filtros de fibra de vidrio pre-consumidos (GF/F) y consumidos a N2 para determinar el d 15N. En las plantas y en los animales es extremadamente sencillo analizar una composición isotópica completa, especialmente en el caso del d 15N, d 13C y d 35S. Las muestras se secan, se muelen, se someten a combustión y se analizan, generalmente usando un sistema automatizado como el descrito arriba.

Las fracciones de DON ricas en N incluyen ácidos de amonio, proteínas y fenoles. Ya que existe una amplia variedad de moléculas orgánicas disueltas que contienen nitrógeno que se pueden analizar para determinar el DON-d 15N, los análisis dependerán, sobre todo, de cómo se procesa la muestra de agua después de que a ésta se la quite el N de partículas. Los métodos para aislar el DOM para su posterior combustión a N2 y análisis de d 15N se extienden desde la liofilización muy simple de la muestra, a la adición de varios métodos posibles antes de la liofilización, incluyendo el retiro del DIN por cromatografía iónica (Bronk y Glibert, 1991), ultrafiltración para aislar una fracción de peso molecular específico seguida por cromatografía iónica, roto-evaporación seguida por diálisis para quitar el DIN (Feuerstein et al., 1997) y el paso a través de varias resinas para separar diversas fracciones por sus características químicas (Aiken et al., 1979; Thurman y Malcolm, 1981).

Los gases también pueden ser recogidos y analizados para determinar el d 15N, d 18O y otros isótopos de interés. Normalmente, los gases se recogen en una jeringuilla a prueba de gas, botellas con tapones-septa o recipientes de muestras evacuados especialmente diseñados. Las muestras pueden necesitar ser sometidas a combustión, y posteriormente se purifican sobre una línea de vacio o mediante paso a través de un cromatógrafo de gas antes del análisis. Un muestreador de espacio libre automatizado conectado con el espectrómetro de masas puede reducir grandemente la mano de obra requerida para el análisis.

En nitratos también se puede analizar el d 18O del NO3-. Amberger y Schmidt (1987) describen un método por el que la muestra se convierte a KNO3, se somete a combustión con Hg(CN)2 para producir CO2 que se purifica a -128ºC  usando una mezcla de N2 líquido y metilciclohexano y se analiza para obtener el d 18O.   

Una modificación del método elimina la necesidad de usar materiales peligrosos tales como el cianuro de mercurio para convertir la muestra a AgNO3 y someterla a combustión con grafito para lograr productos cuantitativos de CO2

Las precisiones analíticas de este método son del  ± 0,5‰ para el d 18O. Un método de combustión de laboratorio Revesz et al. (1997) proponen un método en el que las muestras en forma de KNO3 reacciona con grafito catalizado y da precisiones excelentes. También para el análisis del 18O en aguas subterráneas mediante el espectrómetro de masas se puede usar la técnica de equilibrado de CO2 (Epstein y Mayeda, 1953) con una reproductivilidad analítica de ± 0,1‰.

 

 
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